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如何進(jìn)行細(xì)胞染色
瀏覽次數(shù):6831發(fā)布日期:2012-06-12

如何進(jìn)行細(xì)胞染色

I.細(xì)胞的染色例

1. 染色例1

以染色HeLa細(xì)胞為例,介紹使用如下試劑的方法

1). 試劑溶液的配制

配制以下的儲(chǔ)備液

Calcein-AM 0.5 mg/ml DMSO solution

BCECF-AM 1 mmol/l DMSO solution

CFSE 1 mg/ml DMSO solution

CytoRed 1 mmol/l DMSO solution

FDA 0.5 mg/ml DMSO solution

PI 1 mg/ml H2O solution

EB 1 mg/ml H2O solution

DAPI 1 mg/ml H2O solution

AO 1 mg/ml H2O solution

* DMSO solution-20的條件下保存,避免失效

2). 器具

蓋玻片 18 mm × 18 mm

培養(yǎng)皿直徑約35 mm)

鑷子

3). 操作

1) 5.0 ml PBS(-)溶解10 μl儲(chǔ)備液,配制成染色液。

*由于用DMSO溶解的儲(chǔ)備液在水溶液中易分解,所以染

色液要現(xiàn)配現(xiàn)用,放置長(zhǎng)時(shí)間后不能染色。

2) HeLa細(xì)胞用Trypsin-EDTA制成細(xì)胞懸液。

3) 將細(xì)胞懸液離心分離速度: 1,000 rpm,時(shí)間: 3分鐘。

4) 去除上清液,加入PBS(-),控制細(xì)胞數(shù)量在105-106 個(gè)/ml。

5) 用移液槍吹打充分。

6) 1.5ml微管中加入30 μl4) 步得到的細(xì)胞懸液。

7) 加入15 μl染色液。

8) 蓋上蓋子,在37的條件下,孵育15-30分鐘。

9) 10 μl8) 步的染色溶液滴加在蓋玻片上, 上面再覆蓋

另一張蓋玻片。

10) 將蓋玻片放在熒光顯微鏡下,用染色試劑對(duì)應(yīng)的激發(fā)波

長(zhǎng)觀察。

2. 染色例2

MitoRed染色細(xì)胞為例,介紹使用如下試劑的方法

1).試劑溶液的配制

配制以下的儲(chǔ)備液

MitoRed 1 mmol/l DMSO solution

78 μl DMSO溶解150 μgMitoRed)

*DMSO solution-20的條件下保存,避免失效

2). 操作

1) 用培養(yǎng)基稀釋1 mmol/l 儲(chǔ)備液。MitoRed終濃度為:20-

200 nmol/l

*加入到細(xì)胞前,推薦先在37保溫

2) 在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞濃度:1×105- 1×106個(gè)

/ml)。

3) 去除培養(yǎng)基,用培養(yǎng)基:PBSHank,s溶液等輕輕

地清洗。

4) 將稀釋的試劑溶液添加至每孔,在培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)

30-60分鐘。

5) 去除含色素溶液的培養(yǎng)基,添加新的培養(yǎng)基。

6) 用熒光顯微鏡觀察。

固定細(xì)胞的時(shí)候,在第4) 步的操作后按以下步驟操作。

5) 去除MitoRed溶液,用不含血清的培養(yǎng)基, PBS

Hank,s溶液清洗。

6) 10%中性 福爾馬林緩沖液,固定15-20分鐘。

7) PBS清洗。

8) 用熒光顯微鏡觀察。

P-7-1 j) 染色HeLa細(xì)胞的熒光圖像。

3. 染色例3

介紹以Hochest 33258,33342染色細(xì)胞為例

1). 試劑溶液的配制

配制以下的儲(chǔ)備液

Hochest 33258 1 mg/ml H2O solution

Hochest 33342 1 mg/ml H2O solution

細(xì)胞固定液:1%戊二醛/PBS(-)

培養(yǎng)液:PBS(-)

2). 操作

1) 將含約1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基離心5分鐘

速度:400 x ),去除上清液。

2) 加入100 μl細(xì)胞固定液,采用吹打等方法,充分混合。

3) 在室溫下靜置30分鐘。

4) 離心5分鐘速度:400 x ),去除上清液。加入1 ml

PBS(-)混合后,再離心5分鐘速度:400 x )。

*此操作為了充分清洗掉戊二醛,如果存在戊二醛,會(huì)導(dǎo)致淬滅。

5) 加入20 μl PBS (-),混合后加入4 μl熒光色素,再混合。

6) 1滴細(xì)胞染色液在載玻片上,將蓋玻片蓋在上面。

7) 用熒光顯微鏡觀察。

P-7-1 k)、I)染色正常人胎兒細(xì)胞的熒光圖像。

 

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